SSH差减文库的构建介绍

SSH（suppression subtractive hybridization）技术是1996年由Diatchenko等发展起来的，它是一种鉴定、分离组织细胞中选择性表达基因的技术。其原理是以抑制性多聚酶链反应(PCR)反应为基础的cDNA 消减杂交技术. 通过合成两个不同的接头，连接于测试cDNA 片段的5’末端，达到选择性扩增差异性表达的cDNA 片段，抑制非目的cDNA的扩增。该技术与其他消减杂交技术相比具有假阳性率低、敏感性高、效率高等优点而得到广泛应用。该方法运用了杂交二级动力学原理，即丰度到的单链DNA在退火时产生同源杂交的速度快于丰度低的单链DNA，从而使原来在丰度上有差别的单链DNA相对含量达到基本一直。而抑制PCR则是利用链内退火优于链间退火的特性，使非目的序列片段两端反向重复序列在退火时产生类似发夹的互补结构，无法作为模板与引物配对，从而选择性地抑制了非目的基因片段的扩增。这样即利用了消减杂交技术的消减富集，又利用了抑制PCR技术进行了高效率的动力学富集。

我公司采用Clontech公司PCR-SelectTMcDNA Subtraction Kit构建差减文库，操作精准、经验丰富，已完成上百个SSH文库的构建（包括植物组织、动物组织、临床样本、微生物等各种样本）。

SSH技术基本原理：

SSH技术利用抑制性PCR能选择性扩增不同丰度差异基因和cDNA 消减杂交特点,运用杂交二级动力学原理（即高丰度序列退火时产生同源杂交的速度大于低丰度序列）,使原本不同丰度的DNA序列相对含量趋于一致。然后利用抑制性PCR特点,两端接上同一接头的非目的基因片段由于具有反向重复序列,在退火时容易形成发夹互补结构,在PCR中不能作为模板与引物配对扩增,从而选择性扩增目的基因而抑制非目的基因片段扩增。消减杂交扣除了实验组和对照组之间同源序列,再结合抑制性PCR的动力学富集,实现高效分离低丰度特异性非同源片段。

服务要求：

进行SSH文库构建时，请尽量提供新鲜的组织和标本，植物组织在5g以上，动物组织在0.5g以上。上海以外地区最好用干冰寄送。

如果提供Total RNA，则需保证纯度(浓度在500 ng/μl以上，体积在 20 μl以上)。如果需要纯化mRNA，应尽量提供更高浓度的和更多的Total RNA。